|
==1. שלבים בהתפתחות האוכלוסייה המיקרוביאלית :==
[[תמונה:Bacterial growth.png|left|thumb|250px|כיתוב תמונה]]
==א. שלב ההמתנה / ההסתגלות / Lag - שלב A בתמונה ==
===א. שלב ההמתנה / ההסתגלות / Lag - שלב A בתמונה ===
שלב בו התאים מסתגלים למצע הגידול. ההסתגלות כוללת הכנה לחלוקה (גידול התא וייצור כל המולקולות הביולוגיות הדרושות כמו למשל אנזימים הנדרשים לגדילה והתחלקות.
שלב ההסתגלות מתארך ככל שההבדל בין מצע הגידול ממנו התחלנו ומצע הגידול הנוכחי גדול יותר. שלב Lag מתרחש בשני מצבים :
#במעבר מתנאים קשים לתנאים חדשים, למשל מהקפאה (תרבית מוצא) לתרבית מזרע.
#כאשר מעברים משלב עמידה למצע טרי. התרבית מתחילה את הגידול מחדש.
===ב. שלב הגידול המואץ (Log) / גידול לוגריתמי / גידול אקספוננציאלי -==
1.במעבר מתנאים קשים לתנאים חדשים, למשל מהקפאה (תרבית מוצא) לתרבית מזרע.
2.כאשר מעברים משלב עמידה למצע טרי. התרבית מתחילה את הגידול מחדש.
===ב. שלב הגידול המואץ (Log) / גידול לוגריתמי / גידול אקספוננציאלי -===
שלב בו הגידול הוא הטוב ביותר ומתואר בגרף שבמקורו בגרף עקום ובעזרת חישובים מתמטיים הגרף שונה לישר (לשם הנוחות).
===המשוואות שרצוי לזכור (לרוב המשוואה הראשונה ניתנת בבגרות):===
* lnXt = µt + inXo
* ln(Xt / Xo) = µt
* g = ln2 / µ
'''שימו לב :''' ליחידות ריכוז החיידקים המופיע על הגרף (L) – ישנן 2 אפשרויות (log ו-ln).כאשר נתון ל-ln אין צורך ללחוץ במחשבון על ln (הפעולה כבר בוצעה).
המשוואות שרצוי לזכור (לרוב ניתנות בבגרות):
===מקרא===
* '''Nt –''' ריכוז תאים סופי. יחידות מידה : תאים למ"ל , Cells/ml, תאים / מ"ל.
*''' Xo -''' ריכוז תאים התחלתי. יחידות מידה : תאים למ"ל , Cells/ml, תאים / מ"ל.
*''' t –''' זמן. יחידות : שעות , hrs
*'''µ - ''' קצב גידול. יחידות מידה : לשעה, 1/שעה, 1/ hr, hr-1.
* '''g -''' זמן דור. יחידות מידה : שעות, hrs.
lnXt = µt + inXo
ln(Xt / Xo) = µt
g = ln2 / µ
מקרא
Nt – ריכוז תאים סופי. יחידות מידה : תאים למ"ל , Cells/ml, תאים / מ"ל.
Xo - ריכוז תאים התחלתי. יחידות מידה : תאים למ"ל , Cells/ml, תאים / מ"ל.
t – זמן. יחידות : שעות , hrs
µ - קצב גידול. יחידות מידה : לשעה, 1/שעה, 1/ hr, hr-1.
g - זמן דור. יחידות מידה : שעות, hrs.
'''זמן דור -''' הזמן שעובר עד לקבלת שני תאי בת. בכל זמן דור מוכפל מספר תאים. זזמן דור מושפע מכמה גורמים :
* תנאי הסביבה – ככל שיותר טובים, כך זמן הדור יותר קצר.
* זן המיקרואורגניזמים :
•תנאי הסביבה – ככל שיותר טובים, כך זמן הדור יותר קצר.
**חיידקים : בין 50 ל-60 דקות.
**שמרים : בין 70 ל-120 דקות.
•זן המיקרואורגניזמים :
**פטריות בין 2-7 שעות.
==ג.שלב העמידה / שלב הגידול סטציאונרי==
-חיידקים : בין 50 ל-60 דקות.
-שמרים : בין 70 ל-120 דקות.
-פטריות בין 2-7 שעות.
===ג.שלב העמידה / שלב הגידול סטציאונרי===
אוכלוסיית המיקרואורגניזמים נכנסת לשלב העמידה עקב שני גורמים :
#ירידה בריכוז מרכיבי מצע חיוניים (החשוב מבניהם הוא חמצן).
#עליה בריכוז הפרשות התאים, ברובם חומרים מזיקים.
'''מאפייני תאים בשלב העמידה :'''
1.ירידה בריכוז מרכיבי מצע חיוניים (החשוב מבניהם הוא חמצן).
#קטנים משמעותית בהשוואה לשלב הגידול המואץ.
#עמידים בפני קרינות ותוספת חומרים מוטגנים (מחוללי מוטציות).
2.עליה בריכוז הפרשות התאים, ברובם חומרים מזיקים.
מאפייני תאים בשלב העמידה :
1.קטנים משמעותית בהשוואה לשלב הגידול המואץ.
2.עמידים בפני קרינות ותוספת חומרים מוטגנים (מחוללי מוטציות).
===ד.שלב התמותה===
כאשר חיידק מת (=אינו יכול להתרבות עוד), הוא עובר ליזיס. ישנם זנים של חיידקים / שמרים / פטריות מייצרי נבגים (= ספורה – חיידק רדום עטוף במעטפת קשיחה והפעילות המטבולית בו שואפת לאפס. עם שיפור תנאי הסביבה מעטפת הנבג נושרת והוא הופך לחיידק פעיל). יצור הנבגים (=ספורולציה) מתרחש בשלב התמותה.
==הקשר בין שלבי גידול חיידקים לתהליך התסיסה==
===הקשר בין שלבי גידול חיידקים לתהליך התסיסה===
שלבי הגידול ל חיידקים זהים לשלבי ריכוז התוצר המבוקש בתהליך התסיסה. המונחים בתהליך התסיסה :
#'''טרופופאזה –''' מקבילה לשלב הגידול המואץ בו נוצרים המטבוליטים הראשונים (תוצרי תהליך פירוק או בנייה בתא).
#'''אדיופאזה –''' מקבילה לשלב העמידה בו נוצרים מטבוליטים שניוניים.
[[קטגוריה : ביוטכנולוגיה]]]
1.טרופופאזה – מקבילה לשלב הגידול המואץ בו נוצרים המטבוליטים הראשונים (תוצרי תהליך פירוק או בנייה בתא).
2.אדיופאזה – מקבילה לשלב העמידה בו נוצרים מטבוליטים שניוניים.
==2. גישות עיקריות לאיתור יצרנים פוטנציאליים של תוצרים חדשים==
===איך מוצאים את המיקרואורגניזם החשוד כמייצר התרופה הנחוצה?===
חיפוש מיקרואורגניזמים יצרנים מתבצע בנישות אקולוגיות קיצוניות, בהן שוררים תנאים מיוחדים. למשל :
•לאיתור אנזימים הפעילים בטמפרטורות גבוהות נחפש מיקרואורגניזמים תרמופילי (שחי בטמפרטורות גבוהות) במעיינות חמים.
•לאיתור אנזימים הפעיל בריכוזי מלח גבוהים נחפש מיקרואורגניזמים הלופילי (אוהב מלח) בים התיכון.
===שיטות סריקה (=בדיקה האם "התרופה" פועלת) :===
'''א.in vivo (בתוך גוף בע"ח) - ''' בדיקת התרכובת "החשודה" בתוך גוף של בע"ח ומעקב אחר פעילות התרכובת בתוך הגוף. השיטה הזו אינה יעילה מכמה סיבות :
•אף אחד אינו מבטיח שתגובה בבע"ח יהיה זהה לתגובה של גוף אנושי.
•כל ניסוי נמשך המון זמן ומספר הניסויים מוגבל (כמה ארנבות כבר אפשר לנצל?).
•השקעה כספית אדירה בטיפול יומיומי ורפואי בבע"ח.
•גוף של בע"ח הוא מערכת מורכבת- אין אפשרות לקבוע בוודאות על מה התרופה השפיעה, אפה היא הזיקה וכדומה.
'''ב.הגישה התאית (In situ) –''' במקום השתמשות באורגניזם שלם, הבדיקה של השפעת התרכובת נעשת על תא בודד או מספר תאים.
'''ג.הגישה המולקולארית (In Vitro) –''' בודקים השפעת התרכובת ישירות על החומר עליו היא אמורה להשפיע. אין פה מערכת ביולגית חיה והכול נעשה במבחנות.
דוגמא למבחן סריקה בגישה התאית :
דוגמא ראשונה :
רוצים לבדוק : האם חומר א' מבטל פעילות של פניצילנאז (= B לקטמאז).
ידוע כי : פניצילנאז חומר אשר נמצא בחיידקים העמידים לפניצילין (כלומר מפרישים את החומר).
הבדיקה נעשת : גידול חיידקים עמידים לפניצילין ולאחר גדילה הוספה אליהם את חומר א'. אם החיידקים לא גדלים סימן שהחומר טוב.
דוגמא שנייה :
רוצים לבדוק : האם אנזים פרוטאז הכן מפרק חלבון.
ידוע כי : חיידק מסוים מפריש פרוטאז.
הבדיקה נעשת : גידול חיידק על מצע עם קזאין (סוג חלבון). אם נוצר איזור צלול סביב המושבה האנזים פועל.
===דרכים להגדלת כושר הייצור של תוצר מבוקש= איתור יצרני יתר===
הקדמה : ישנם שני סוגי מטבוליטים : מטבוליט ראשוני (בניה ופירוק- מטבוליט קבוע בתא) ושניוני (במצב עקה) ולהם 2 דרכים שונות להגלת כמותם.
==מטבוליט ראשוני==
'''שני גישות להגדלת יצירת ייצור:'''
א.גישה ביוכימית – טיפול באמצעות שינוי ריכוזים של מולקולות אורגניות בתא, שינוי תנאים חיצונים וכדומה. כלומר, נשנה רמת פעילות אנזימטית בהתאם לצורך באמצעות שינויים ביוכימיים בלבד ("יצירת" תנאים מתאימים). דוגמא לשימוש יצור חומצה ציטרית.
ב.הגישה הגנטית – יצירת שינויים מבוקשים ברמת הדנ"א.ייצור היתר של התוצר ישמר לאורך דורות – שינוי קבוע.
'''באופן כללי ישנם 2 אפשרויות לקבלת כמות תוצר גדולה יותר :'''
א.הגברת ייצור של החומר המבוקש.
ב.הפחתת ניצול החומר המבוקש על ידי התא ובכך יש יותר כמות מהתוצר.
===המישור הגנטי ===
החדרת שינויים להגדלת כמות תוצר מתבצע בשני דרכים :
'''א.מוטציה.'''
מוטציה – מתרחשת בשלב הכפלת הדנ"א במסגרת חלוקת התא בעקבות שינוי ברצף הבסיסים או בחומצת הגרעין בדנ"א. ישנם 2 דרכים ליצירת מוטציה :
א.פיזיקאלי – קרינות שונות (uv, x ועוד).
ב.כימית – חומרים מוטגנים (מעודדי מוטגנזה = יצירת מוטציות), למשל כמו אתידיום ברומיד.
רוב המטבוליטים הראשונים מיוצרים '''במנגנון היזון חוזר שלילי''', כלומר התוצר הסופי במסלול מעכב את מסלול היווצרותו.
והיה והחומר שאנו רוצים בעל מנגנון שכזה, יהיה ניתן לייצרו בעודף. לאחר תהליך יצירת המוטנטים הגורם להריגת רוב התאים, נחפש את המוטנט אותו אנו רוצים ושרד. המוטנט המבוקש יכול ליצור בשני דרכים עודף מהחומר הרצוי (בעל מנגנון היזון חוזר שלילי) :
1.מוטנט הפגוע באנזים בקרה (E4 בציור) - אם האנזים אינו פועל, אין מעכב ליצירת D. איתור המושבה המייצרת בעודף את החומר קשה לזיהוי ומתבצע תהליך ארוך.
2.פגיעה בייצור תרכובת הבקרה (A)- במצב זה נוצר מוטנט אוקסוטרוף ל-A (כלומר, מוטנט שאינו יודע ליצר חומר נחוץ ונדרש לקבלו מבחוץ) שהיא תרכובת הבקרה. שימוש במוטנט אוקסוטרוף בעל יתרון כיוון שקל יותר לאתרו ע"י שימוש "בשיטת העשרה".
"שיטת העשרה"
בכדי להמחיש את השיטה ניתן דוגמא לשימוש בשיטת העשרה.
מציאת פניצילין.
הרציונל / ידוע כי :
- פניצילין פוגע רק בתאים מתחלקים.
- מוטנטים אוקסוטרופים אינם גדילים אם אין תרכובת הבקרה.
ביצוע האיתור :
1.שתילת המושבות ששרדו על מצע בעל פניצילין.
2.כל החיידקים שאינם חיידקים אוקסוטרופים מתים בעקבות הפניצילין ומי שנשאר חי הם האוקסוטרופים שאינם מתחלקים כי חסר להם מרכיב.
3.העברה למצע גידול טרי ללא פניצילין עם תרכובת בקרה לייצור כמות רבה של החיידק מיצר היתר.
'''ב.רקומבינציה -'''איחוי של מרכיבים גנטיים ממקורות שונים. בניגוד למוטציה הרקומבינציה מחייבת ידע קודם על הגנים של המיקרואורגניזמים וזהו הגורם המגביל בה. שני דרכים לשימוש בשיטה זו :
א. איחוי פרוטופלסטים (in Vivo):
פרוטופלסט – תא חסר דופן, בעל תכונה להתחבר עם פרוטופלסט אחר וליצור פרוטופלסט חדש עם תכונות של שני הפרוטופלסטים. למשל : ליצירת יצרן יתר של ליזין מיוצר פרוטופלסטים משתי מקורות :
חיידק א' – מייצר ליזין ביתר.
חיידק ב' – מפרק גלוקוז בקצב מוגבר (יותר אנרגיה).
יחד – "סופרמן" של ייצור ליזין.
ב. רקומבונציה (In Vitro) - הנדסה גנטית
* ביצוע ה"ג בחיידקים מאפשרת החדרה של גן מסוים מזן א' לתוך חיידק ב' מזן אחר.
* בחיידקים לא מחדירים את הזן הזר לתוך הכרומוזום העיקרי אלא למולקולה דנ"א מעגלית חוץ כרומוזימלית קטנה הנקראת פלסמיד.
* בחיידק אחד יכול להיות עד 100 עותקים של כל פלסמיד.
דוגמא : העברת הגנים המעורבים בייצור טריאונין מזן המייצר בעודף לתוך פלסמיד והחדרתו לחיידק מובילה לייצור יתר מוגבר (מפני שהפלסמיד מופיע מאה פעמים ולכן גם התוצר).
==מטבוליט שניוני==
בניגוד למטבוליט ראשוני לו אנו יודעים את המסלולים שהוא עובד, למטבוליט שניוני אין לנו כמעט ידע ולכן איתור יצרן היתר נעשה על ידי ניסוי וטעייה, אמפרי (תוך כדי ניסוי).
תחילה מייצרים מוטנט על תרחיף נבגים ומבין אלה השורדים מתחילים לבצע מבחני סריקה הספציפים לחומר הרצוי.
| 