ביוטכנולוגיה/אנזימי הגבלה
אנזימי רסטרקציה (הגבלה) – אנזימים השייכים למשפחת הנוקלאזות (=אנזימים המפרקים דנ"א). כל אנזימי ההגבלה שייכים לתת המשפחה שנקראת אנדונוקלאזות (חותכים באמצע מקטע הדנ"א).
אקסונוקלאזות – אינם אנזימי הגבלה. חותכים בקצה של מקטע הדנ"א.
כיצד גילו את אנזימי הרסטריקציה?
עריכהלוריא והומן חקרו את התופעה בה חיידק נדבק ע"י בקטריופאג'ים. כידוע, הבקטריופאג' מחדיר את החומר התורשתי שלו אל החיידק ובכך משתלט על מערכות האורגניזם. אולם, גם לחיידק ישנם מנגנוני הגנה. לוריא השתמש במונחים כללים לתאר את התופעה, כיוון שהוא לא גילה כי "כלי המלחמה" של החיידקים היו אנזימי ההגבלה. הוא טען כי החיידק והבקטריופאג' עוברים שינוי בדנ"א. אם השינוי זהה, החיידק לא יוכל להתגבר על הבקטריופאג'.
בשנת 1962, גילה ארבר, כי השינוי נעשה בעקבות הוספת קבוצת מתיל באתר ההגבלה (באורך 4-8 בסיסים) ע"י "אנזים מתילאז" (מתילאזות לבסיס A או לבסיס C). כך, החיידק מרשה לעצמו לשלוח אנזימי הגבלה כנגד הבקטריופאג', אם לבקטריופאג' אין מתיל ברצף של החומר התורשתי שלו, הוא יפורק על ידי החיידק, והחיידק ימשיך לחיות.
סמית' המילטון היה החוקר הראשון שזהה אנזימי הגבלה ואת האתר אותו הוא חותך.
חשיבות אנזימי הגבלה (רסטרקציה):
עריכה- באמצעות אנזימי רסטרקיציה ניתן להנדס מקטעי דנ"א, לשבט ועוד.
- באמצעות אנזימי הגבלה ניתן ליצור מפת הגבלה עבור מקטע דנ"א.
- מציאת Ori בגנום מעגלי.
מאפיינים של אנזימי הגבלה (רסטרקציה):
עריכה- כל אנזים הגבלה מסוגל לזהות רצף מסוים וספציפי שרק אותו הוא מסוגל לחתוך בנקודה מסוימת.
- קיימים סוגים רבים של אנזימי הגבלה (נובע מסעיף אחד).
- החיתוך מתבצע על ידי פירוק הקשר בין הנוקלאוטידים (קשר פוספו-דיאסטרי).
- קיימים סוגים שונים של חיתוך - חיתוך מדורג וחיתוך חלק (בהמשך הסבר).
אתרי ההגבלה
עריכהאתר רסטרקציה / הגבלה – מקטע של בסיסים מסוים, אותו יכול לחתוך אנזים ההגבלה מסוים.
מאפיינים של רצפי/אתרי ההגבלה :
- פלינדרומים – רצפים זהים בשני הגדלים (כפי שהמילה אמא נקראת משני הצדדים).
- רצפים קצרים בני 4-12 זוגות בסיסיות.
סוגי חיתוך: חיתוך חלק / חיתוך מדורג
עריכה
- חיתוך חלק – מתקבל מקטע דנ"א דו גדילי.
- קצוות חלקים (blunt end) – הם קצוות של דנ"א דו גדילי.
חיתוך מדורג – מתקבל זנב חד גדלי (נראה כמו מדרגה) קצוות דביקים – קצוות דנ"א חד גדילי. קיימים שני סוגים : 3'ssDNA (קצוות חד גדילי שהם 3') ו-5'ssDNA.
מכאן שקיימים 3 סוגי דרכי חיתוך :
- 5' sticky ends (5' חיתוך מדורג) – קצה 5', הוא חד גדילי.
- 3' sticky ends (3' חיתוך מדורג) – קצה 3, הוא חד גדילי.
- קצה חלק (blunts) – כל מקטע הדנ"א שהתקבל הוא מולקולה דו גדילית.
חשיבות הקצוות הדביקים
עריכהמהן ההשלכות בעצם של הקצוות הדביקים ? הקצוות הדביקים , משמע הם קצוות שנמשכות אחד למשנהו בזכות הקשרי המימן בינהם . החיתוך המדורג מלכתחילה שואף להתחברות . בעקבות חיתוך כזה , והשאיפה שלו להתחבר , הקצוות יהיו קרובים אחד לשני עד מאוד , דבר שיאפשר לאנזים הליגאז לחבר בינהם. ולכן, כאשר יש אפשרות לבחור בין חיתוך חלק לבין החיתוך המדורג - נבחר בחיתוך המדורג - שבו הסיכוי שהמקטעים יתחברו יהיה גדול יותר מזה שבחיתוך החלק.