ביוטכנולוגיה/אסטרטגיות שיבוט

הקדמה - מה קורה כאשר אנחנו לא יודעים היכן הגן?

לפעמים, יש בידנו מקטע דנ"א ואין אנו יודעים היכן נמצא עליו הגן אותו אנו רוצים לשבט. במקרים כאלה אנו נעזרים בספרייה. קיימים 2 סוגי ספריות.

ספרייה גנומית / ספרית דנ"א

ספריה גנומית/דנ"א – אוסף מושבות של חיידקים המכילים פלסמידים המייצגים את כל המקטעים של גנום (חומר התורשתי של אורגניזם) אחד. כלומר ספריה שכזו תכיל : גנים, רצפי בקרה, דנ"א "זבל" ועוד.

דנ"א גנומי – כלל החומר התורשתי של אורגניזם אחד.

מטרה  :

• בשביל לשבט גן שלא ידוע מיקמו בגנום.
• בשביל לשבט מקטעי דנ"א שהם רצפי בקרה.

בניית ספרייה גנומית :

• מקטע דנ"א (שזו למעשה דנ"א גנומי) בו קיים הגן הרצוי .
• חיתוך (המקטע) אקראי באנזימי רסטרקציה.
• יצירת דנ"א רקומביננטי - עבור כל מקטע החיתוך נבצע רתימת הגן לנשא ושיבוט (תלוי אם מדובר בחיידק או בנגיף).
• ספרייה - קבלת צלחת ועליה מגוון של מושבות. כל מושבה בעלת מקטע שונה של הדנ"א.
• מציאת הגן המבוקש – בפרק הבא.

חשיבות ספרייה גנומית - חסר

ספריית דנ"א משלים / c-DNA

ספרית דנ"א משלים – ספרייה בעלת רצפי הגנים של הגנום.

מטרה: בשביל לשבט גן שלא ידוע מיקמו בגנום.

מדוע צריך ספרית דנ"א משלים?

לספריות דנ"א יש בעיה עיקרית אחת – הן מכילות כמות גדולה של דנ"א שאינו דווקא דנ"א של גן, כך הן מכילות רצפי בקרה, דנ"א "זבל" ועוד. בנוסף לכך, רצפי הגנים הם בגודל עצום וגדול. כאשר חוקר רוצה לחקור ולשבט גן מסוים, קשה לו למצוא ולשבט רצף גן אם הוא הגיע מספרייה גנומית.

הרעיון מאחורי ספריה גנומית

כל תכונה (צבע שיער, סוג עיניים...) נוצרת עקב ייצור של חלבון. כל גן יוצר חלבון. אנו יודעים שבכדי שגן "יהפוך" להיות חלבון הוא עובר מספר תהליכים (שעתוק ותרגום). להלן שלבי התהליך בקצרה (תא איקריוטיים):

• מקטע דנ"א (מקטע של גן).
• אנזים RNA פולימראז מעתיק את המקטע ונוצר mRNA + שחבור.
• mRNA מגיע אל הריבוזום שם הוא עובר תהליך תרגום ליצירת חלבון.

תהליך השחבור (Splicing) בתא : בתהליך השחבור מוצאים מקטעי האינטרונים (introns) ונשארים רק האקסונים.

האינטרונים – הם מעין מקטעי בקרה; הם קטעים שאינם פעילים ואינם חשובים ליצירת החלבון. לכן, אין צורך בהם בשלב התרגום.

מכאן, שמולקולת ה-mRNA שמתקבלת קטנה משמעותית מרצף הדנ"א של אותו הגן.

הרעיון מאחורי ספרית דנ"א משלים הוא יצרת ספריה מ-mRNA. mRNA מעניק 2 תכונות לספרייה :

• קטן הרבה יותר בגלל שעובר את תהליך השחבור.
• גן - רצף המקודד ליצירת חלבון.

בניית ספריית דנ"א-משלים:

שלב א'

בניגוד לרצף הדנ"א הנמצא בכל תאי הגוף (בתוך הגרעין), mRNA מופיע רק בתאים בו החלבון בא לידי ביטוי. לכן, אנו נחפש את mRNA בתא בו יש קיימת התכונה (כלומר יש יצור חלבון). למשל : אם חוקר רוצה למצוא את הגן לצבע שיער כהה, הוא ייקח mRNA מתאי שיער, אם חוקר רוצה לייצר אינסולין הוא יבחר בתא לבלב, וכדומה (ולא מתאים אחרים : תאי דם, עצם, עור ועוד כיוון שבהם התכונה לא בא לידי ביטוי).

שלב ב' – סינתזת (בנית) דנ"א ממולקולת ה-mRNA באמצעות RT

מה הבעיה עם mRNA? ומהם הפתרונות?

mRNA היא מולקולה חד גדילית ולכן לא ניתן להחדיר אותה לפלסמיד שהינו מולקולה דו גדילית.

פתרון : שימוש באנזים RT שהינו אנזים המסוגל לייצר דנ"א ממולקולת RNA.

CDNA / דנ"א משלים– מולקולה דנ"א שמקורה ברנ"א.

האנזים RT (האנזים המתעתק במהופך)

האנזים RT הוא אנזים ייחודי הקיים ברטרו-וירוסים. כידוע, וירוסים יודעים להחדיר את החומר התורשתי שלהם אל תא פונדק. החומר התורשתי של רטרו וירוסים הוא רנ"א. לכן, כאשר וירוס חודר אל תוך תא אנימלי, הוא מעתיק את הרנ"א שלו לדנ"א, על מנת שהחומר התורשתי שלו יתרבה בתא האנימלי וכך הוא יוכל להשתלט על התא, כמו פועל למשל הנגיף HlV1 המחולל איידס.

דרישות האנזים RT :

• תבנית mRNA לשכפול.
• dNTP's – נוקליאוטידים חופשיים מכל 4 הסוגים (dCTP, dTTP, dGTP, dATP)
• פרימר פולי T – הקצה של mRNA מסתיים בבסיסי AAA...

שלבי הסינתזה ע"י RT (האנזים המתעתק במהופך):

• קישור פרימר מתאים (אוניברסאלי לכל הגנים האאוקריוטים – פולי T).
• השלמת הגדיל על פי רצף תבנית ה-mRNA. כך מתקבל היבריד (מולקולת כלאיים) דו גדילית אשר גדיל אחד שלו הוא דנ"א והשני mRNA.
• פירוק כימי של גדיל ה-mRNA.
• הוספת דנ"א פולימראז להשלמת גדיל הדנ"א וקבלת מולקולת דנ"א דו גדילית שמקורה ב-mRNA.

שלב 3 - שיבוט

שיבוט – החדרת מקטעי הדנ"א הדו גדילי (שמקורו מ-mRNA) לנשא.

שלב 4 - ריבוי

ריבוי – טרנספורמציה (אלקטרופורציה או מלח CaCle + שוק חום וקור) לחיידקים. כל חיידק בעל רצף של גן אחר (המצויים בתא הספציפי).

חשיבות ספריית דנ"א משלים - חסר

סיכום – השוואה בין ספריה גנומית לספריית דנ"א משלים :

• גודל – ספרית דנ"א משלים קטנה משמעותית מספרייה גנומית, כיוון שהיא אינה מכילה את כל הגנים, אלא רק את האלה הבאים לידי ביטוי בתא.
• הרכב – ספרייה גנומית מכילה רצפים שלא יכולים לבוא לידי ביטוי בספרייה CDNA למשל רצפי בקרה (פרומטורים) ועוד.

קישורים חיצונים

• מצגת "ספריית גנים" (בעמוד 13 יש תמונה הממחישה את ההבדלים בין שתי הספריות).