ניקוי התוצר

כמו שנלמד קולונת הT-GEL נשטפת תחילה בעזרת 4 שלבים שנכתבו על ידי פרופ' ל' רוזנברג בשנת 1999, מכללת תל חי.

הפרדת התוצר - הרחקת המסה המיקרוביאלית

בתום תהליך הייצור עם ריקון הפרמנטור נוצרים תוצרים, שאריות חומרי גלם, מיקרואורגניזמים, חומרי לוואי שהופרשו ועוד. השלב הראשון בהפקת התוצר הוא הפרדת החומרים המסיסים מהחומרים הלא ממסיסים (המרכיבים העיקרים שאינם מסיסים במערכת הם המיקרואורגניזמים – התאים עצמם), ליצירת עוגת תאים או משחת תאים. ישנן שתי שיטות להפרדת חומרים מסיסים מלא מסיסים והן:

סרכוז- הכנסת חומרים לצנטריפוגה בו מופעל כוח צנטריפוגלי הגורם למרכיבים הכבדים, הלא מסיסים לשקוע (בגלל המשקל הסגולי). המשקע נקרא עוגת תאים או משחת תאים המכיל את המיקרואורגניזמים עצמם (בדרך כלל).
זיקוק- הפרדת חומרים המצויים בנוזל עפ"י נקודת הרתיחה של כל חומר, בעזרת מערכת קירור ניתן להפוך את הגז בחזרה לנוזל.
הפרדה על פי גודל-
- שקית דיאליזה: ממברנה מלאכותית בעלת נקבובית בגודל מסויים. רק מולקולות שגודלן קטן או שווה לגודל הנקבובית יכולות לצאת החוצה. מולקולות גדולות יותר נשארות בתוך השקית. הדיאליזה יעילה בהרחקת מולקולות קטנות (מלחים ודטרגנטים) מתמיסת החלבונים.
- הפרדה במסננת (ממברנה) מולקולרית: עמודה המכילה ג'ל נקבובי בגודל רצוי. מולקולות חלבון גדולות לא חודרות לנקבוביות ויוצאות ראשונות מהעמודה, מולקולות חלבון קטנות חודרות לנקבוביות, מתעכבות ויוצאות מאוחר יותר. ההפרדה היא לפי גודל המולקולה של החלבון.מתאימה לסינון תאים ושמרים
- אלקטרו פורזה בג'ל: ההפרדה החשמלית מתבצעת בג'ל מסוג פוליאקרילאמיד. בג'ל זה יש נקבים בגודל של החלבונים (בערך). מולקולות חלבון גדולות יותר ינועו יחסית לאט יותר בעוד שמולקולות קטנות יותר ינועו מהר יותר. הג'ל מורכב מקוטב חיובי וקוטב שלילי ולכן יש מעבר תמידי של המולקולות מצד אחת של הג'ל לצידו השני.
- פילטר - בנוי מחומר המכיל מחילות מפותלות. חומרים ממסים עוברים דרך הפילטר בעוד התאים נתקעים במחילות ולא זורמים החוצה. פילטר מתאים להפרדת פטריות חיטיות.
הפרדה לפי מסיסות-
- מיצוי: ניתן למצות (להפוך לתמצית) תוצרים מסויימים על ידי המסה המערכת דו-פאזית של שני ממסים.
- כרומטוגרפיה: הפרדת התוצר לפי המסיסות. טובלים חומר כגון נייר או חומר סופג אחר בתוך תמיסה כגון מים או אתנול. התמיסה מתחילה "לטפס" במשטח וכשהיא פוגשת את טיפת התערובת היא גוררת את מרכיביה איתה, מרכיבי התערובת שאינם יוצרים אינטראקציות חזקות עם המשטח מטפסים במהירות עם התמיסה אל קצה המשטח ואילו והמרכיבים שיוצרים אינטראקציה עם המשטח זוחלים באיטיות.
- שיקוע במלח אמוניום סולפט: החלבונים יהיו במצב מסיס כל עוד הם יכולים להיות באינטראקציה עם המים. כאשר ריכוז המלח גבוה נוצרת תחרות בין החלבונים לבין המלח על הקישור למולקולות המים. בריכוז מלח מסויים המלח מנצח ונוצרת אינטראקציה בין חלבון לחלבון במקום בין חלבון למים. מולקולות החלבון נדבקות אחת לשניה ושוקעות. לחלבונים שונים יש סף שקיעה שונה בריכוזה מלח שונים.
הפרדת התוצרים על פי מטען חשמלי- ה-pH שבו לחלבון אין מטען נטו נקרא ה-pH האיזואלקטרי. מסיסות החלבון ב-pH זה היא מינימלית, היות וכוחות המשיכה האלקטרוסטטיים בין מולקולות החלבון הם מירביים והן נוטות לשקוע עקב היווצרות צברים. ב-pH האיזואלקטרי החלבון שוקע בצורה הטבעית שלו, וניתן להמיסו מחדש בתמיסה בעלת pH מתאים.
עמודת מחליף יונים- שיטה המפרידה עפ"י שנוי במטען החשמלי של חלבונים בעלות ערך pH שונה. ב-pH שונים, חלבונים שונים ייספחו לעמודה הטעונה במטען החשמלי המנוגד להם, או עשויים להידחות ממנה אם המטענים זהים. אניון- שלילי, קטיון- חיובי.
עמודת זיקה- שיטה המפרידה עפ"י פעילות ביולוגית ספציפית. משתמשים בשרף שקשורות אליו מולקולות ליגנד (סובסטראט של אנזים). הליגנד אינו מסיס מפני שהוא קשור בקשר קוולנטי לשרף. רק חלבונים שיש להם זיקה ביולוגית לליגנד שעל השרף ייקשרו לשרף.

סוגי התוצרים האפשריים

לאחר הפרדת התוצרים ישנם 3 תוצרים אפשריים :

הביומסה (התאים = המייצרים, הם התוצר. כמו שמרים) – כאשר התוצר המבוקש הוא התאים עצמם, לאחר הסרכוז לוקחים את המשקע בו מטפלים טיפול קצר שבתומו התוצר מוכן.
תוצרים חוץ תאים - חומרי לוואי של התא, אלו חומרים שיוצרו על ידי התאים במערכת והופרשו אל מחוץ לתא. לדוגמא אתנול, אנטיביוטיקה ועוד. בכדי לקבל תוצר זה אנו לוקחים את הנוזל העליון לאחר הסרכוז.
תוצרים תוך תאים - אלו חומרים המיוצרים על ידי המיקרואורגניזמים ואינם מופרשים החוצה, כמו למשל, חומצת אמינו. בכדי להשיג תוצרים אלו יש לקחת את המשקע (התאים) ולשבור אותו.

דרכים לשבירת תאים - שבירת תאים להפקת תוצרים תוך תאיים

ישנן דרכים רבות לשבירת תאים, אנו נפרט על שלושה מהם (לבגרות אין צורך ליותר) :

טיפול אנזימטי - מתבצע באמצעות האנזים לזוזים המפרק דפנות חיידקים, כלומר שובר קשרים כימים בפפטידוגליקן (המרכיב הבונה את הדופן שעשוי מחלבונים וסוכרים). בעקבות שבירת הדופן מים נכנסים לתא והתא מתפוצץ (הממבראנה נקרעת בעקבות כניסת המים)
הפעלת גלי קול בתדירות גבוהה (=סונקציה)- המכשיר שולח גלי קול לתוך התמיסה בתדירות שנקבעת מראש. גלי הקול שוברים את דופן התא, הממבראנה והדנ"א. ההבדל בין ליזוזום לסונקציה הוא שבטיפול אנזימטי משאיר את מולקולות הדנ"א שלמים ולכן יש צורך בטיפול אנזימטי נוסף (או ביצוע טיפול בליזוזים ו- DNase במקביל שמפרק את הדנ"א). היתרון של סונקציה שגם הדנ"א מתפרק בשלב אחד (החיסרון יש לעשות הפסקות).
שינוי לחץ אוסמוטי - בכל סבוב נעשה הקפאה והפשרה וכך התא מתקבץ ומתרחב בשלב מסוים של הקפאה שלילית התא יתפוצץ (כמו גומי).

הערה : פעמים רבות לאחר שבירת התא, אנו נעזר שוב בסינון או סרכוז, כיוון שהחומר שלנו יכול להיות משקע או נוזל. לאחר הסרכוז/סינון נבצע הפרדה ע"י שיטת הפרדה המתאימה ספצפית לתוצר המבוקש, כלומר, על פי התכונות הידועות לנו על התוצר.

שיטות הפרדה לניקוי התוצר - הפרדת תוצרים בהתאם לתכונותיהם

השלב האחרון הוא ניקוי התוצר משאר המרכיבים האחרים בתא. ישנן שיטות רבות להפרדה אותן בוחרים על פי תכונת התוצר המבוקש.

סעיף	הפרדה על פי תכונה	דיאגנוסטי (שיטה לאבחון)	פופרטיבי (שיטה לקבלת חלבון נקי)
1.5.2	הפרדה על פי מטען	אלקטרופורזה	השקעה איזואלקטרית (ב- pI), כמוטוגרפיה של מחליפי יונים
1.5.3	הפרדה על פי גודל	אלקטרופורזה ב- S.D.S	כרומטוגרפית סינון בג'ל (ג'ל פילטרציה / מסננת מולקולארית), שקית דיאליזה.
1.5.5	הפרדה על פי זיקה ביולוגית	-	כרומוטגרפיה של זיקה
1.5.1	הפרדה לפי מסיסות	-	השפעת ריכוזי מלח (אמוניום סולפט) על חלבונים שונים In /Salting Out Salting
1.5.4	הפרדה על פי קוטביות (סרגל PI – מתי ח.א שלילי, חיובי ונטרלית)	-	-
נוספים	השקעה על פי נקודת רתיחה	-	-
	הפרדה לפי צפיפות (משקל סגולי)	-	צנטריפוגה בגרדיאנט צפיפויות
	צנטרפוגה במהירויות שונות Differential Centrifugation	-	-

שקית דיאליזה

כאשר רוצים להפריד חלבון ממולקולות קטנות (מלחים, יונים ועוד) או להפרדת חלבון גדול מחלבונים קטנים.
השיטה מתבססת על הדיפוזיה (השוואת ריכוזים) ובה לוקחים שקית דיאליזיה (= שגודל נקביה ידועים) ומכניסים אליה את התערובת עם החלבון הרצוי. השקית מוכנסת לכלי גדול בו בופר.

במהלך ההפרדה הטבעית, המולקולות הקטנות יצאו מהשקית אל הכלי עד השוואת ריכוזים ואנו נחזור על התהליך שוב ושוב עד לניקוי מלאה.

ג'ל פילטרציה / מסננת מולקולארית

כאשר רוצים להפריד חלבונים שונים בגדלים שונים או ממולקולות לא חלבוניות. השיטה מתבצעת בקלונה בה יש שרף היוצר מחילות בגדלים שונים ובעקבות כך חלבונים גדולים אינם מצליחים להיכנס למחילות ולכן יוצאים ראשונים ואילו החלבונים הקטנים כן מצליחים להיכנס ולכן מסלולם בקולונה ארוך יותר והם יוצאים אחרונים.

צנטריפוגה בגרדיאנט צפיפויות

הכנסת מלח או סוכר למבחנה עם מים להקפיא ולהפשיר. חזרה על התהליך שלוש פעמים ובעקבותיו נוצר שבמעלה המבחנה יש 0% סוכר ולמטה פי שניים ממה שלקחנו. עתה מוסיפים את התערובת בה החלבון הרצוי לניקוי. החלבון ימצא ב-0% סוכר כיוון שקל יותר מהסוכר.

המבחנה נלקחת לחדר אטום ומופעל על צינטרפוגה חזקה (50 אלף סיבובים לשנייה). כל החלבונים עתה מסודרים לפי גודל בין ריכוזי הסוכר השונים, כלומר אם יש 40% סוכר, שם יהיה 40 ק"ג סוכר. שיטה זו טובה כשיש צבע לחלבון. והיה ואין צבע יש להמשיך בטיפול ב-SDS.

השפעת ריכוזי מלח (Ammonium Sulfate fractionation)

השיטה

הוספת אמוניום סופלט אל התמיסה. כתוצאה מכך, תיווצר תחרות בין יוני המלח לחלבונים שבתמיסה על היקשרות למולקות המים (הממס).

חלבונים פחות מסיסים ישקעו בריכוזי מלח נמוכים.
חלבונים ממסים ישקעו בריכוזי מלח יותר גבוהים.

Salting Out - הסבר לשיטה

יש בחלבון חומצות אמינו הידרופוביות (לא יוצר קשר עם מים) והידרופיליות (יוצרות קשר עם מים).
ריכוז גבוה של מלח גורם להימשכות מולקולת מים.
בעקבות כך, חומצות האמינו ההידרופיליות יש פחות קשרים עם המים והן מתכנסות בעצמן.

כידוע, מלח בריכוזים מסוימים גורמים לחלבון לעבור דנטורציה. השיטה מתבססת על הוספת כמות מלח ידועה שתגרום לדנטורציה עבור החלבונים הלא רצויים (מתבטא בשקיעת חלבון).

חלבונים הפחות מסיסים ישקעו בריכוזי מלח נמוכים.
חלבונים ממסים ישקעו בריכוזי מלח יותר גבוהים.

הפרדה לפי נקודת רתיחה

מתאים לחומרים שנקודת הרתיחה שלהם נמוכה מזו של המים. התהליך הוא זיקוק. למשל : להוצאת אתנול מחממים את הכלי לנקודת הרתיחה שלו שהיא 78 מעלות צלזיוס. האתנול מתחממם על שהופך לגז אותו אוספים ושמים במקום אחר.

השקעה איזואלקטרית

מטען של חלבון נקבע על פי המטען של חומצות האמינו המשתנה לפי ערך ה-PH בו הן נמצאות.
השיטה מבוססת על ה-PH האיזאולוגי של חלבון (ה-PH בו החלבון בעל מטען נטרלי, שווים אפס), בו החלבון עובר אגרגציה (נוצר גוש של אותו חלבון). האגרגטים (= גוש החלבונים) נוטים לשקוע עקב כובדם. והיה ורצינו חלבון כזה נשים את החלבון ב-PI (ה-PH האיזאולוגי) שלו והוא יופרד ללא חלבונים נוספים.

חומרים העלולים להיות בתערובת ולהפריע

מלח – יוני מלח שמתפרקים (למשל : ⁺Na ו- ^-Cl) אשר נקשרים אל החומצה האמינית ומשנות את מטענה.
הפתרון : הוספת מיסוך יונים שיקשרו ליוני המלח.
ממיסים אורגנים (בוטנול, אצטון, CCl4)– הם חומרים הידרופוביים ולכן חלבונים הידרופוביים אינם שוקים עקב האינטרקציה (=הקשר) שנוצר. לעומת זאת חומרים הידרופיליים ישקעו מהר יותר ולכן ניתן להשתמש בכמויות קטנות (בכדי לא לפגוע בחלבון) של ממיסים אורגנים לזירוז התהליך.

אלקטרופורזה

הנחת חלבון על מרכז תווך סופג או על ג'ל פולימרי בתוך בופר בשדה חשמלי. החלבונים נעים לאלקטרודה החיובית או השלילית על פי :

מטענם (שלילי ינועו לקטרודה ; חיובים ינועו לאנודה)
צפיפות – ככל שיש יותר מטען, כך החלבון ימשך חזק יותר.
גדול – חלבונים קטנים נעים מהר יותר ולכן יגיעו ראשונים.
התווך (המשטח) מהו חיכוך החלבון עם התווך? גודל החורים של הפולימר על התווך? ועוד

(SDS PAGE (Sodium Dodecy Sulphate Poly Acrylamide Gel Electrophoresis

החלבונים מטופלים בחומר הנקרא SDS הגורם להם להיות בעלי מטען שלילי ולכן ההבדל בניהם הוא גודלם. החלבונים מורצים לתוך "חורים" על דף הרצה עליו סמן מולקולארי (MW Marker) שהינו תערובת של חלבונים בעלי משקע ידוע, כך שנוכל לדעת את משקל החלבון.

הג'ל המשמש להרצה בנוי מפולימר של חומר אקרילאמיד שיוצר מרקם מוצק ועליו יש "חורים" שניתן לשלוט בגודלם ע"י שינוי האקרילאמיד.

בכדי לראות את התמונה של החלבונים (שלרוב שקופים), צובעים בצבע מיוחד הנקרא קומסי (צבע כחול) את הג'ל וגורם לצביעת החלבונים (ולא הג'ל).

כרומוטוגרפיה על מחליפי יונים

שרפים שנושאים מטען חשמלי מושכים אליהם את החלבונים בעלי המטען השונה וכל אלה בעלי המטען הזהה אליהם יוצאים החוצה בעקבות דחייה.

קיימים שני דרכים לשחרור המטען (=אילוציה) שנקשר אל הקולנה :

שינוי ה-PH ע"י הכנסת בופר בעל PH שונה.
הוספת מלחים שיקשרו במקום החומר לשרף.בכדי לשכלל את התהליך ניתן להזרים מלחים בעלי ריכוז עולה ובעקבות כך החלבונים בעלי המטען החלש ביותר משתחררים ראשונים והחזקים אחרונים. כך, על ידי שטיפה רציפה של גרדיאנט (רצף עולה של ריכוזים) מלח, מובטח חלבון נקי.

בסוף התהליך יש להשתמש בשיטה נוספת, המומלצת היא SDS בכדי לדעת איזה חלבון יש בכל מבחנה.

כרומוטגרפיה של זיקה/כרומטגרפיית זיקה אימונית (Affinity Chromatography\Immunoaffinity chromatography)

בכרומוטגרפית זיקה משתמשים במולקולה ביולוגית ספציפית (ליגנד) שמקובע, היודעת להיקשר לחלבון בעל זיקה (יכולת להיקשר) ספציפי, לניקוי של חומרים בעלי פעילות ביולוגית. החלבונים בעלי זיקה הם :

נוגדן אליו נקשר אנטיגן.
אנזים אליו נקשר סובסטרט (מצע).
הורמון אליו נקשר קולטן.

עקרון השיטה

לביצוע השיטה כמה שלבים:

קישור כימי של הליגנד אל פני מצע בלתי מסיס למים, ואריזת המצע לתוך עמודה.
הרצת התערובת המיועדת להפרדה. האנטיגן המבוקש נקשר לעמודה (אינו זורם החוצה) ושאר המרכיבים נשארים בתמיסה ונשטפים החוצה.
אנלוציה (הוצאת החלבון המבוקש : ניתוק הקשר בין האנטיגן המבוקש לנוגדן המקובע) - מתבצעת בדרכים שונות על ידי שטיפת הקולונה : שיוני התכונות הפיסיקליות/כימיות של התמיסה המועברת דרך העמודה, שטיפה בתמיסה ליגנדים חופשים הקושרים אליהם את האנטיגנים (= החלבונים) ועוד.
אסיפת הנוזל שיוצא מן העמודה- תמיסה נקייה יחסית של האנטיגן.

הערה - אנזים וסובסטרט

אם ברצוננו לנקות אנזים מתערובת, אנו נקשור אל העמודה סובסטרט מדומה, כיוון, שאם לא, האנזים ישנה מרחבית את הסובסטרט (E+S=P) ויהפוך אותו לתוצר. בעקבות כך, הסובסטרט (שהפך לתוצר) ישתחרר מהעמודה, וכך גם, האנזים. כלומר, לא נפיק מהתהליך דבר.

חסרונות

שיטה זו יעילה מאוד אך בעלת חסרונות :

עובדת עם מולקולות ליגנד.
יקרה מאוד.

יתרונות

דרגת ניקיו גבוהה.

תחומי השימוש

כיום משתמשים בשיטה זו גם במעבדה וגם בתעשייה לבידוד של הורמונים, נוגדנים, אנזימים, מקטעי דנ"א, ופפטידים שונים.

בתעשייה משתמשים בשיטה זו כשלב סופי בניקוי חלבונים.

הפרדה על פי קוטביות

פרק זה לוקה בחסר. אתם מוזמנים לתרום לוויקיספר ולהשלים אותו. ראו פירוט בדף השיחה.

צנטרפוגה במהירויות שונות (Differential Centrifugation)