ביוטכנולוגיה/מעבדות/ניסוי - קביעת ריכוז חלבון בשיטת ביורט

מבוא

כיום ישנם כמה סוגי בדיקות המאפשרות לקבוע ריכוזי חלבונים. במעבדה זו השתמשנו בבדיקת ביורט. בדיקת ביורט מבוססת על חלבונים בעלי שתי חומצות אמינו או יותר בריכוזים בין 1-10 מ"ג\מ"ל. בתמיסה יוני הנחושת נמשכים לאטומי החנקן והחמצן שבקשרים הפפטידים ונוצר לנו תצמיד שממנו ניתן לראות צבע-בעצם לראות שינוי בצבע התמיסה (מכחול לסגול). מכאן אפשר להסיק שככל שצבע התמיסה חזק יותר יש ריכוז גבוהה יותר של חלבון בתמיסה הנבדקת.

מהלך העבודה

1. הכנת סדרת מבחנות ומספורן מ7-0.
2. הכנסת ריכוז מתאים של החלבון אלבומין לכל אחת ממבחנות 6-0 מתמיסת האם של אלבומין בריכוז 10 מ"ג\מ"ל.
3. הכנסת 7 מ"ל תמיסת נעלם למבחנה מספר 7.
4. השלמת נפחי המבחנות ל-1 מ"ל ע"י הוספת מים מזוקקים והוספת 4 מ"ל מגיב ביורט לכולן.
5. קריאת הבליעה של כל אחת מן המבחנות באורך גל של 540nm.

מסקנות

בעקבות התוצאות שיצאו לנו וקבלת המשוואה של גרף בליעה (באורך גל של 540 ננומטר) בריכוזי חלבון שונים ניתן למצוא מהו ריכוז החלבון בתמיסת הנעלם (באמצעות הצבה במשוואה שיצאה לכם אחרי עיבודה הנתונים). לדוגמא:

${\begin{aligned}y=0.2397*x+0.015\\0.276=0.2397*x+0.015\\X=1.0888\\\end{aligned}}$

על פי החישוב אנו יודעים כי ריכוז החלבון בתמיסת הנעלם הוא 1.0888.

שאלות ותשובות

תרגיל 1: בניסוי איפסת את הספקטרופוטומטר עם התוכן שבמבחנה 0. מדוע עדיפה שיטה זו על השימוש במים מזוקקים לצורך זה?

עדיף להשתמש בתוכן מבחנה 0 מכיוון שמבחנה זו מכילה את כל החומרים שנמצאים בכל שאר המבחנות חוץ מהחומר שאותו אנחנו רוצים לבדוק- במקרה שלנו , חוץ מהחלבון אלבומין. וכאשר נקרא את הבליעה של תמיסה זו(מבחנה 0) ונאפס את הספקטופוטומטר לפי תמיסה זו נוכל למדוד מה הבליעה האמיתית של החלבון בכל המבחנות בגלל שהמכשיר יקזז את הבליעה של כל שאר החומרים שבתמיסה ויראה לנו רק את הבליעה של החלבונים הנמצאים בתמיסה. ואז נוכל באמת ליצור גרף כיול שיש בו יחס נכון בין כמות הבליעה לריכוז החלבון.

תרגיל 2: האם אפשר להשתמש בתוצאות הניסוי הזה לקביעת ריכוזי חלבון מחוץ לתחומי עקומת הכיול (מעל 10 מ"ג\מ"ל או מתחת ל1 מ"ג\מ"ל)?
הספקטופוטומטר מוגבל ואינו יכול לקרוא את הבליעה של ריכוזים גבוהים מאוד של החומר הנבדק(במקרנו-חלבון) ולכן כאשר נעבור את ריכוז זה ויהיה לנו ריכוז גבוה של החלבון הספקטופוטומטר לא יבדיל לנו בין הריכוזים ויראה לנו לכל ריכוזים אלו את אותה הבליעה. ולכן אם נרצה להשתמש בעקומת הכיול שהכנו (בטווח המסוים) לא נוכל. ואם בכל זאת נרצה נצטרך למהול\לרכז את התמיסה ואז להכפיל\לחלק בהתאם.