ביוטכנולוגיה/קביעת רצף הנוקליאוטידים ב-דנ"א (שיטת סנגר)

חשיבות השיטה : השיטה עזרת לקבוע את הרצף של הנוקליאוטידים של גדיל דנ"א.

תיאור השיטה :

ההבדל בין סוגי הנוקלאוטידים המשמשים בשיטת סנגר

השיטה מתבססת על פגיעה ביצרת מולקולת דנ"א חדש. סנגר השתמש בשני סוגי נוקליאוטידים:

• הסוג הרגיל (dNTP) – נוקליאוטידים בעלי סוכר 5 פחמני מסוג דיאוקסי (בפחמן '2 חסרה קבוצה קרבוקסילית) ריבוז.
• DdNTP's – אלו נוקלאוטידים שבעמדה '2 ובעמדה '3 חסרה מולקולת חמצן (ראה תמונה).

כיוון של-DdNTP אין מולקולת חמצן, לא ניתן לחבר אליו נוקליאוטיד. בנוסף, מולקולות ה-ddNTP'S מסומנות פלורוסנטית בצבעים שונים עבור כל אחד מ-4 בסיסי הקיימים.

כלומר, בסיום הפעולות של השיטה, אנו מקבלים רצפים שונים של דנ"א, בגדלים שונים, כאשר הנוקליאוטיד האחרון (שהוא למעשה ddNTP) מסומן בצבע, בהתאם לבסיס שלו.

הפעולות שמבצעים :

• הפרדת גדילי הדנ"א המיועד לריצוף בחימום.
• הצמדת פרימר מתאים בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס.
• הוספת דנ"א פולימראז להארכת הגדילים. לשם פעילות האנזים, מוסיפים נוקליאוטידים מסוג dNTP's, וכן גם, נוקליאוטידים מסוג ddNTP's (בריכוז נמוך).
• קבלת רצפי דנ"א בגדלים שונים המסומנים בסופם בצבעים שונים, בהתאם לבסיס שלהם.

עקרון ההרצה בג'ל למיפוי ופענוח הרצף (דוגמא)

מקרא : T – A – G - C

שלב א' - הצמדות הפרימר :

5'ATGCGCGATAT3'

          TA5'

שלב ב' – כלי ובו מקטעים שאת גודלם אנו לא יודעים

הרצה בג'ל

המקטעים הם בגדלים :

1. ATA3' – הנוקליאוטיד הנמוך ביותר
2. TATA3'
3. CTATA3'
4. GCTATA3'
5. CGCTATA3'
6. GCGCTATA3'
7. CGCGCTATA3'
8. ACGCGCTATA3'
9. TACGCGCTATA3' - הנוקליאוטיד הגבוה ביותר

שלב ג' : הרצה בג'ל

המולקולות הקטנות רצות הכי רחוק. 2 עקרונות :

1. קריאת הרצף מלמעלה ללמטה (הבסיס הראשון הנמצא ב-'5, נמצא ברצף הכבד ביותר – צריך הכי הרבה נוקליאוטידים על מנת להגיע אליו).
2. תוך כדי קריאה הופכים את הבסיסים לפי התאמה (A-T, G-C) – כיוון שהרצף שנוצר הא רצף משלים.

כלומר, על פי 2 העקרונות, הרצף המשלים הוא :

5'ATGCGCGATAT3'

.

למי שקשה לרשום את הרצף המשלים כבר בתחילה, יכול לרשום את הרצף המצוי בג'ל (מלמעלה ללמטה) ולאחר מכן לרשום את הרצף המשלים. כלומר :

הרצף המצוי בג'ל תעתוק מלמעלה ללמטה) :

5'TACGCGCTATA3'

הרצף המשלים :

'5ATGCGCGATAT3'