ביוטכנולוגיה/רתימת הגן לנשא

מושגים

שיבוט – בידוד וריבוי של גן מבוקש.
דנ"א רקומביננטי (r-DNA)– דנ"א המכיל קטעי דנ"א שהוחדרו אליו בהנדסה גנטית.

פלסמיד

שלב ההכנה

בחירת האתר המתאים על הנשא, לצורך החדרת הגן – לפני החדרת הגן לנשא, יש לוודא תחילה כי גם לנשא ולמקטע הדנ"א המבוקש, קיימים אתרי הגבלה זהים, הנחתכים בידי אותם אנזימי רסטרקציה. כמו גם, נעזרים במפת ההגבלה לקביעת גודל הפלסמיד שהתקבל, להיכן יוחדר המקטע המבוקש ועוד.

הכנת דנ"א רקומביננטי ( r-DNA) - שלבי החדרת גן באמצעות פלסמיד :

מקטע דנ"א המיועד לשיבוט.
חיתוך מקטע הדנ"א באמצעות אנזימי רסטרקציה – יש ההעדפה לעבודה בחיתוך מדורג כיוון שיש חשש כי הדו גדיל יתהפך. אם רוצים לשנות את הקצה נעזרים ב-linkers.
כומוטוגרפיה – הרצת המקטעים על ג'ל אגרוז בנוכחות אתדיום ברומיד (צבע זוהר).
מציאת המקטע המבוקש על פי גודלו בג'ל אגרוז.
חיתוך פלסמיד באמצעות אותם אנזימי רסטרקציה.
הוספת הפלסמיד + הדנ"א למבחנה בנוכחות AP (למניעת חיבור הפלסמיד מחדש).
הוספת ליגאז – מחבר בין הפלסמיד למקטע הדנ"א.
טרנספורמציה – החדרת הגן לתוך החיידק.
בידוד השבט המבוקש – אחד מתכונות הפלסמיד היא העובדה שיש לו גן בורר. לכן, גידול בנוכחות גורם הסלקציה, תביא לגדילת החיידקים בעלי הפלסמיד בלבד.
שיבוט – ריבוי הפלסמיד (100-200 עותקים) וריבוי החיידק.
קבלת התוצר – התוצר הוא חוץ תאי כיוון שהחיידק אינו יודע מה לעשות עם החומר.

טרנספורמציה – החדרת הגן לתוך החיידק מתבצעת בשתי שיטות :

מלח CaCle + שוק חום וקור – יוצר חורים בממברנת החיידק ובכך מגביר את סיכוי חדירת הפלסמיד אל החיידק.
אלקטרופורציה – יצירת פתחים בממברנה באמצעות זרם חשמלי.

שלבי החדרת גן באמצעות בקטריופאז'ים (נגיפים) :

הערה : תא הפונדק, החיידקים יהיו חיידקים חסרי אנזימי רסטרקציה (הפוגעים בוירוסים).

השלבים זהים מאוד לשלבים בהחדרת גן באמצעות פלסמיד :

מקטע דנ"א המיועד לשיבוט.
חיתוך מקטע הדנ"א באמצעות אנזימי רסטרקציה – יש ההעדפה לעבודה בחיתוך מדורג כיוון שיש חשש כי הדו גדיל יתהפך. אם רוצים לשנות את הקצה נעזרים ב-linkers.
כומוטוגרפיה – הרצת המקטעים על ג'ל אגרוז בנוכחות אתדיום ברומיד (צבע זוהר).
מציאת המקטע המבוקש על פי גודלו בג'ל אגרוז.
חיתוך נגיף באמצעות אותם אנזימי רסטרקציה.
שימוש באנזים ליגאז לאיחוי בין הגן לנשא.
הדבקת החיידקים.

הדבקה :

על מצע מוצק נזרע רובד של חיידקים.
נפזר על החיידקים את הנגיף המכיל את הגן.
הפאג' מחדיר את הדנ"א שלו לחיידק אחד בלבד.
החיידק עובר ליזיס בעקבות ההדבקה.
הוירוסים שהתרבו בחיידק, מדביקים חיידקים סמוכים.
על הצלחת אנו מקבלים מוקד (plaque – פלאק) – צלחת מלא בפאג'ים.

מה קורה כאשר אין התאמה בין הפלסמיד לרצף הדנ"א שרוצים להחדיר?

חוליות מקשרות (linkers)

שתי מטרות לצרוף חוליות מקשרות (linkers) :

שינוי קצה חלק (blunt end) לקצה מדורג.
שינוי הקצה המודרג.

Linker (8-14bp)‎ – מקטע דנ"א חד גדילי ואו דו גדילי.

שינוי הקצה לקצה אחר – הוספת linker לקצה וחיתוך באמצעות אנזים רסטרקציה, לקבלת קצה דביק הרצוי/אחר.

תכונות ה-linker הרצויות:

צדו האחד של ה- linker צריך להשלים את רצף הבסיסים של הקצה אותו אנו רוצים לשנות.
ה-linker יכול להיות דו גדילי (קצוות חלקים) ואו חד גדילי, תלוי בסוג הקצה.

חיבור זנבות הומופולימריים

פרק זה לוקה בחסר. אתם מוזמנים לתרום לוויקיספר ולהשלים אותו. ראו פירוט בדף השיחה.