ביוטכנולוגיה/שיטות החדרת גן לתא צמחי

יתרון החדרת גנים לצמחים:

• גידול מהיר יותר של תוצרים.
• השבחת פירות וירקות - הארכת חיי מדף, טעם ועוד.
• שיבוט – יצור צמחים בעלי יכולות מיוחדות שלצמח רגיל אין.

חסרון:

ישנם מיני צמחים בהם קשה לשחזר צמח שלם מפרוטופלסטים, בעיקר ממשפחת הדגניים.

הסטוריה ומציאת השיטה

פלסמיד Ti

על החיידק אגרובקטריום טומפציוס

• החיידק אגרובקטריום טומפציוס – חיידק הגדל בקרקע באופן טבעי. הוא מחולל את המחלה "עפץ הכתר" שהיא מחלה סרטנית הנוצרת עקב פציעה.
• העפץ – מסת תאים סרטנים המייצרים חומר ייחודי – אופינים ההכרחי לחיי החיידק לעיל.
• אגרובקטריום טומפציוס מכיל פלסמיד $\ P^{Ti}$ הגורם להדבקת הצמח.

מבנה הפלסמיד ($\ P^{Ti}$) בטבע

1. T-DNA – המקטע המועבר לצמח בעל הגנים לגידול סרטני ויצור אופינים שהצמח לא יודע ליצר באופן טבעי.
2. גבול ימין ושמאל – האזורים המזוהים על ידי חלבוני ה-Vir ומגדירים איזה מקטע גני הוא הT-DNA ויועבר לצמח (מסומנים בכתום בתמונה בשמאל).

כיצד נוצרים סמני המחלה?

• סרטן - נוצר עקב תכונת הגן (הנמצאת ב-T-DNA לייצור מוגבר של ההורמונים אוקסנים וציטוקנינים).
• ייצור אופינים – עקב גן המקודדים לחלבון היוצר אופינים.

בעיות בהחדרת פלסמיד - יצירת פלסמיד מהונדס

בעיה I : ייצור מוגבר של ההורמונים גורם לפגיעה בהתמיינות התא ובכך נמנעת התפתחותו של צמח שלם.

הפתרון : הוצאת הגנים היוצרים הורמונים באופן מוגבר.

בעיה II : הסלקציה עבור התאים שקלטו את הפלסמיד קשה לביצוע.

הפתרון : החדרת גן המקנה עמידות לקנמיצין במקום הגנים המייצרים הורמונים באופן מוגבר.

בעיה III: $\ P^{Ti}$ הוא פלסמיד ענק ולכן אינו יכול להיכנס בטרנספורמציה.

פתרון : לפתרון מספר שלבים :

1. לקיחת מיני Ti – פלסמיד שאינו מכיל Vir.
2. ליגציה - הכנסת מקטע הדנ"א הרצוי לתוך הפלסמיד.
3. החדרתו לחיידק אגרובקטריוס מהונדס שמכיל רק פלסמיד בעל Vir.
4. הדבקה תא צמח – פציעת הצמח. Vir מייצר חלבונים החותכים מיני Ti ומעבירים למקטעי הדנ"א הצמחי.

מגבלות השיטה: מתבצעת רק עבור צמחים דו פסיגים, מכיוון שחיידקי אגרובקטריום אינם תוקפים צמחים חד-פסיגיים.

השלבים בתהליך קבלת צמח שלם מהונדס

לאחר הדבקת הצמח, לוקחים מאזור הפציעה את התאים מרקמת הפצע, מוספים הורמונים מתאימים וכך גדל צמח חדש בעל הגן המבוקש.

תותח גנים

כדורי טונגסטן או זהב עטופי זהב ערום דנ"א נורים לעבר עלה (בלחץ גבוה). ישנם 4 אפשרויות שיכולות לקרות :

1. הכדור פוגע בעלה ויוצא מהצד השני.
2. הכדור מגיע לצמח אך לא משולב בגנים.
3. הכדור מגיע לצמח משתלב בגנום ופוגע בפעילות חיונית של גן.
4. הכדור מגיע לצמח, משתלב בגנום וחודרת ביעילות.

יתרון: זול.

חסרון: יעילות נמוכה, פגיעה בצמח.

וירוסים צמחים

וירוסים יכולים לשמש כחומר המחדיר גן לצמח, כיוון שהם מבצעים זאת באופן טבעי.

חסרונות - הבעיות עם וירוסים :

• מגוון עצום של וירוסים – כל אחד ספציפי למין מסויים.
• לא יכולים להעביר מקטעי דנ"א גדולים.
• אין העברה לדורות הבאים – לרוב וירוסים אינם מדביקים תאי עובר ולכן התבנית החדשה לא תועבר לדורות הבאים.

יתרון: מתבצע באופן טבעי, החדרה יעילה כשמדובר.

הערה: שיטה זו לרוב לא נמצאת בשימוש.

החדרה לפרוטופלסט

השלבים בשיטת החדרה זו:

1. הסרת הדופן באמצעות אנזימים תיצור תא פרוטופלסט (ללא דופן). ניתן לעשות זאת ע"י: CaCl2, אלקטרופורציה, מיקרו הזרקה או איחוי פרוטופלסטים.
2. לאחר הסרת הדופן, מורחפים הפרוטופלסטים בתמיסה עם פוליאתילן גליקול (המאפשר מעבר של מולקולות דנ"א דרך הקרום) יחד עם הדנ"א שברצוננו להעביר.
3. בוררים את התאים המותמרים, נותנים להם לפתח דופן חדשה ולגדול בחזרה לצמח שלם.

גן שעבר בשלבים אלו בהצלחה, יעבור לצאצאים בתורשה.

חסרון : יעילות נמוכה, רק פחות מ-1% מהתאים מותמרים בשלב השלישי.

יתרונות : מגוון רחב של שיטות זולות, יעילות עבור הצמחים להם השיטות מתאימות.

אלקטרופורציה

זרם חשמלי מועבר בתמיסה המכילה פרוטופלסטים, פוליאתילן גליקול ודנ"א.

הזרם החשמלי יוצר פתחים בקרומי הפרוטופלסטים וכך הדנ"א יכול לעבור.

אחוזי ההתמרה בשיטת האלקטרופורציה גדולים פי 10 מהשיטה בפסקה הקודמת.