ביוטכנולוגיה/שיטות לאיתור גנים
לאחר יצירת הספרייה המבוקשת (כיום הספריות קיימות מראש), אנו מקבלים צלוחית ועליה מושבות, שכל אחת מהן מכילה מקטע דנ"א אחר מגנום החיידק. כיצד אפשר לזהות את המושבה המבוקשת?
דרכים לאיתור המושבה המבוקשת :
עריכהשיטה זו מחייבת יצירת ספריה עם נשאים יחודיים המאפשרים בניה של ספרית ביטוי.
א. היברדיזציה עם גלאי (probe)
עריכההשלבים :
- תספיג - על גבי צלחת הגידול מצמדים פילטר (מעיין ניילון שקוף) הסופח חלק מן החיידקים במושבה. הפילטר הספוח נקרא תספיג.
- הפילטר מטופל בכימיקלים היוצרים דנ"א חד גדילי.
- מדגירים את הפילטר עם גלאי - מולקולת דנ"א או רנ"א המסומנות רדיואקטיבית או פלורסנטית ומהווה רצף משלים למקטע מסוים בגן המבוקש לאיתור. הגלאי נצמד למקטע המשלים, כך שמתקבל איזור קטן ובו רצף דו גדילי.
- איתר הסימון (רדיואקטיבי או פלורסנטי) על גבי הפילטר.
כאשר מדובר בסימון רדיואקטיבי – מבצעים אוטורדיוגרפיה – הצמדת פילים פיתוח לפילטר. פיתוח הפילים מראה כתם שחור בנקודה בה הייתה התפרקות רדיואקטיבית. המיקום היחסי של הכתם על הפילים ידוע בהשוואה למיקום המושבה המתאימה בצלחת.
כאשר מדובר בסימון פלורוסנטי – נעזרים במיקרוסקופ פלורוסנטי. הארת הפילטר באור UV (אורך גל קצר) מוביל לפליטת אור באורך גל ארוך, בהתאם לסמן הפלורוסנטי הנבחר (האור הנפלט צבעוני וישנם סימנים פלורוסנטיים בעלי צבעים שונים).
הערה :
עריכהשמו לב, כי בספרייה גנומית יש אפשרות לקבל שתי מושבות בעלות רצף דנ"א דו גדילי. מצב זה יקרה בדרך כלל כאשר אנו מחפשים גן. בניגוד לספרית דנ"א משלים, בספריה גנומית אנו מבצעים חיתוך אקראי וכך אנו למעשה עלולים לחתוך את הגן שלו. לכן, תתקבל תמונה בה יהיו 2 מושבות מוארות.
שתי השיטות הבאות מתאימות רק כאשר התוצר המבוקש הוא חלבון. אם ברצוננו לחפש מקטע דנ"א כרצף בקרה – נאלץ להשתמש בגלאי.
ב. באמצעות נוגדן
עריכהאם מקטע הדנ"א המבוקש הוא גן מבני, אשר ממנו נוצר תוצר חלבוני, ואם יש בידנו נוגדן כנגד החלבון הזה, ניתן לסרוק את הספרייה בנוגדן מסומן אנזימטי. המושבה בה מתקבל הסימון הצבעוני של הנוגדן, היא המושבה המייצרת את החלבון.
ג. בדיקת פעילות אנזימטית
עריכהאם החלבון המבוקש כתוצר הוא אנזים ופעילותו ידועה, ניתן לבדוק פעילות אנזימטית על גבי הפילטר ולבחון את מיקום המושבה בה התקבלה הפעילות. המושבה בה יש פעילות, היא זו שמכילה את הגן המבוקש.