ביוכימיה/קביעת סדר החומצות האמיניות בחלבון

הקדמה

באמצעות ידיעת רצף חומצות אמינו בחלבון אנו יכולים :

1. לקבוע בערכה גסה את מטען החלבון ואת ה-pH האיזואלקטרי שלו (PI).
2. לקבוע את גודל החלבון.
3. להעריך מהו המבנה השניוני (למשל : אם ידוע כי יש חומצות אמינו גדולות, נוכל לדעת של יתקיים משטח בטא וכדומה).

בנוסף, באמצעות השוואת רצפים של חלבונים אנו יכולים :

• לזהות אתרים חיונים לפעילות החלבון - ע"פי הופעת חומצות אמינו באתרים קבועים בכל האורגניזמים.
• זיהוי הפגם במחלות תורשתיות - השוואה בין רצף של חומצות האמינו הקיימות בחלבון תקין לבין רצף חומצות אמינו בחלבון פגום.
• חיזוי תכונת החלבון - ניתן לחזות שתי תכונות :
  • משקל מולקולרי (PJ)
  • מיקום החלבון בתא - על פי אופי חומצות האמינו; אם רוב חומצות האמינו הן הידרופוביות, אז החלבון יהיה בממברנה. למשל : החלבון אמפיפאטי (חציו מחוץ לממברנה וחציו בתוכה) יורכב משני חלקים; האחד, הידרופילי, והשני הידרופובי.

שיטה א' - באמצעות ריאגנטים

זוהי הנה השיטה הבסיסית. השלב הראשון מתרחש על שרשרת פפטידית שלא נפתחה. שאר השלבים תלוים זה בזה!

זיהוי חומצות אמינו ב-N טרמינל ו-C טרמינל

שלב זה מתרחש לפני פתיחת השרשרת!

השיטה

מתבצע באמצעות מספר ריאגנטים. המתבצעת כך :

• הוספת הריאגנטים - כל הריאגנטים פועלים באמצעות יצירת קשר קוולנטי עם אחד הקצוות הגורמת ל"תופעה" אותה אנו יכולים לראות.
• ביצוע הידרוליזה – קבלת חומצות אמינו המפרדות זו מזו. אם הקשר הקוולנטי היה חזק (הוא לא נהרס בהידרוליזה), נקבל חומצה אמינית שהייתה בקצה ואליה מחובר ריאגנט.

הריאגנטים

1. ריאגנט סנגר פלואורודיניטרובנזן (FDNB) - החומצה האמינית ב-N טרמינל יוצרת קשר חזק עם הריאגנט שאינו מתפרק בהידרולוזיה. בעקבות הידרוליזה כל החומצות האמיניות מאבדות את קשריהן, פרט, לחומצה ה-N טרמינלית הקשורה אל המגיב שנצבעת בצבע צהוב. מסומן כך : ח .אמינית בקצה האמיני - DNP.
2. דנזיל כלוריד – החומצה האמינית בקצה N טרמינל (הקצה האמיני) מסומנת פלואורסנטית (שוב, היא מקושרת אל הריאגנט).
3. קרבוקסיפפטידאז – חומצה אמינית בקצה C טרמינל (קצה קרבוקסילי) מתנתקת מהשרשרת ראשונה (בעקבות הידרוליזה שמבצע האנזים).

פירוק קשרי S-S

בכדי לקבוע את רצף חומצות האמינו בחלבון באמצעות ריאגנטים, עלינו תחילה לפרק את המבנה השלישוני בכדי לקבל שרשרות פוליפפטידיות, להן נקבע את סדר חומצות האמיניות. על מנת לפרק את השרשרות המחוברות זו אל זו נעזר בחומרים המפרקים קשר דיפדולפידיים. החומרים הם :

1. B מרקפתואתנול – חומר מחזר; גופרית מקבלת מימן.
2. חומצה פרורמית – גופרית הופכת ל-SO3-. החומצה הקרסוקסילית הקטנה ביותר.

קבלת פפטיד ללא קשרי S-S.

הידרוליזה חומצית - פירוק שרשרת

באמצעות חומצת מלח (HCl), בתנאים של 110 מעלות צלזיוס (בכלי סגור לשמירת טמפ') מקבלים תערובת של חומצות אמינו.

שימוש בנינהידרין

ראה : כרומטוגרפיה מחליפי יונים

השיטה

• לוקחים שרשרת פוליפפטידית ומטעינים אותה על מחלף קטיונים ב-pH חומצי. מכאן ש :
  • חומצות אמינו שליליות – יצאו ראשונות.
  • חומצות אמינו חיוביות – יצאו אחרונות.
• האילוציה (שחרור החומצות האמינו מהקולונה) מתבצע בהדרגה. כלומר, מעלים לאט את דרגת ה-pH. כך, משתחררות חומצות האמינו בהתאם לחוזק הקישור שלהם אל השרף (ככל שהן יותר חיוביות, הן יקשרו חזק יותר לקולונה, ולכן יצאו אחרונות).
• לוקחים את המבחנות שהתקבלו ובודקים בליעה בנוכחות החומר נינהידרין שגורם לחומצות האמינו להפוך להיות כחולות, פרט מלחומצה האמינית פרולין (שהופכת לצהובה).
• זיהוי.

זיהוי

• זיהוי סוג חומצה אמינית מתבצע באמצעות יצירת גרף יחוס. יצרת הגרף מתבצע כך :
  • ביצוע הרצה בתנאים זהים עבור כל חומצה אמינית. ההרצה תתבצע על כרומטוגרפיה מחליפי יונים.
  • מבצעים ספקטופוטומטר עבור החומצה האמינית – מגלים את ערך הבליעה עבור החומצה האמינית.
  • בודקים את נפח הבופר - כל חומצה אמינית דורשת נפח שונה של בופר על מנת להשתחרר מהקולונה – מגלים את נפח האלוציה עבור החומצה האמינית.
  • קבלת תוצאות – עבור כל חומצה אמינית קיימת, יש בידנו את ערכי הבליעה שלה, ואת נפח הבופר לו היא זקוקה על מנת להיפרד מהקולונה בה השתמשנו.
• כמות חומצה אמינית - ככל שהצבע חזק יותר, כך יש יותר ח.א מהסוג הנתון.

באמצעות אנזימי חיתוך

• מתאימה לפפטידים קצרים עד 20 ח.א.
• כל השיטות הביולוגית הן אנזימתיות - מתבצעות באמצעות אנזימי הגבלה השייכים למשפחת הפרוטאזות (שוברי קשר).
• לאחר החיתוך תתבצע הרצה על כרומוגורפיה.
• שימוש בשיטה נוספת, בדרך כלל, שיטת אדמן.

סוג השיטה	ריאגנטים	אתר חיתוך	דוגמא
כימית	ציאונוגן ברומיד	חותך אחרי (צד קרבוקסילי) חומצה אמינית Met.	Gly-His-Asn-Met-Ala-Gly Gly-His-Asn-Met Ala-Gly
כימית	הידרוכסילאמין	חותך את הקשר שבין Asn-Gly	Met-Ala-Gly-His Met-Ala Gly-His
ביולוגית	טריפסין	חותך אחרי (צד קרבוקסילי) החומצות האמינו ליזין וארגנין	Met-Trp-Lys-Gly-Ala-Thr-Arg-Thr-Trp Met-Trp-Lys Gly-Ala-Thr-Arg Thr-Trp
ביולוגית	כימוטרפסין	חותך אחרי החומצות האמינות פנילאלנין, טריפטופן וטירוזין.	Tyr-Met-Trp-Ala-Thr-Phe-Gly Tyr Met-Trp Ala-Thr-Phe Gly
ביולוגית	פפסין	חותך אחרי החומצות האמינו פנילאלנין, טריפטופן וטירוזין.

שיטת אדמן

בשיטה זו מופרדת חומצה אמינית, הנמצאת בקצה האמיני (N טרמינל).
ההפרדה מתבצעת באמצעות הריאגנט פנילאיזותיוציאנט בתנאים מותנים בלבד.
לאחר ביצוע הפרדה באמצעות הריאגנט, מתקבלים שני תוצרים :

1. חומצה אמינית.
2. השרשרת פוליפפטידית.

חוזרים על התהליך שוב ושוב עד אשר מוסרות כל חומצות האמינו מהשרשרת.

למעוניין בהרחבה : לחץ כאן

חפיפת המקטעים

בנית רצף פפטידי באמצעות חפיפה של מקטעים זהים. ראה דוגמא : בגרות ביוכימיה 2004, שאלה 3.

קישורים חיצוניים

• קביעת רצף חומצות אמיניות בחלבון –מבנה ראשוני
• תרגול - בביוכימיה תשס"ד שאלה מספר 3 (עמוד 6-7). לפתרון לחץ כאן.