ביוטכנולוגיה/מעבדות/השפעת ה-pH על פעילות האנזים אינברטז
< ביוטכנולוגיה | מעבדות
הקדמה
עריכהבניסוי זה ובניסוי השפעת הטמפרטורה על פעילות האנזים טריפסין אנו נבצע את הנלמד מפרק הלימוד ביוכימיה - השפעת PH על מבנה חלבון. הבנת החומר התאורתי תקל על פתרון השאלות.
פעילות לעצירת פעילות אנזים :
עריכה- חום – דנטורציה.
- סמנר - חומצה חלשה.
ראה : ביוכימיה – מטעני חלבון.
הניסוי
עריכה- אנזים: אינברטאז - אנזים המפרק סוכרוז (סוכר לא מחזר) לגלוקוז ולפרוקטוז (סוכרים מחזרים). מצוי בכמויות גבוהות בשמרי אפייה.
- סובסטרט : סוכרוז.
- קשר גליקוזיצי – קשר בין סוכרים הנוצר ע"י פליטת מולקולת מים. הקשר נוצר בין פחמן קרבוקסילי אחד לפחמן של הסוכר אחר.
נוסחאות
עריכההנוסחאות שיש לדעת :
- פעילות ספציפית (Specific Activity)
- העשרה
- ניצולת
ראה :
- מושגים - שיטות ניקוי- מעקב אחר ניקוי חלבון בטבלת העשרה
- חישובים
מהלך הניסוי
עריכהמציאת pH אופטימלי עבור אנזים
עריכה- שורה של מבחנות בעלות pH שונה עם סובסטרט.
- הוספת האנזים (במקרה שלנו הוספת אינברטאז).
- הוספת מגיב לתוצר הפירוק(סמנר או סמירנוף למשל) או לסובסטרט.
- מרתיחים.
- קריאה (במקרה שלנו באורך גל 540mn) ובדיקת פעילות (ע"פ הגרף שנוצר).
בקרות ואיפוסים
עריכה- מבחנה ללא אנזים וסוכרוז (סמנר בלבד) – לאיפוס ספקטופוטומטר ; נטו ערך בליעה.
- מבחנה עם סובסטרט – לבדיקת פירוק הספונטאני של הסובסטרט.
- מבחנה עם אנזים – לבדיקת פעילות האנזים.
הקשר בין יציבות האנזים ל-pH וטמפרטורה אופטימלי
עריכהאין קשר בין pH וטמפרטורה אופטימאלית לבין יציבות האנזים. יתכן כי האנזים פועל בטמפרטורה או pH מסוים אך אינו יציב.
מהלך הניסוי
עריכה- לקיחת שורת מבחנות בעלות pH שונים עולים.
- הוספה אנזים (אינברטאז) וסובסטרט (סוכרוז) לכל המבחנות.
- הפסקת פעולה אחרי 5 דקות, בהוספת הסמנר (חומצה).
- הנחה במים רותחים.
- קריאת אחוז בליעה (לסמנר" 540nm).
בקרות :
- מבחנה עם סוכרוז - למציאת התפרקות ספונטי של הסובסטרט.
- מבחנה עם אנזים.
- מבחנה ללא סוכרוז ואנזים לאיפוס.
חומר נוסף
עריכהשיטות הפרדת חלבון (דיאגנוסטי פופרטיבי = אבחון לניקוי חלבון)
עריכה- דיאליזה
- כמוטוגרפיה בג'ל.
- ג'ל פילטרציה/מסננת מולקולרית.
- השקעה איזואלקטרית (ב-PI)
- מחליף יונים.
- אלקטרופורזה בנייר.
- כמוטוגרפית זיקה.
- להסברים ראה : שיטות הפרדה
- דנטורציה בחום – ביצוע דנטורציה לחלבונים. כתוצאה מכך כל החלבונים ההידרופוביים יתחברו ויצרו משקע. כמובן, שלא נבצע דנטורציה עבור החלבון המבוקש.
- השקעה במלח
- TLC - הרצה על נייר הידרופילי בנוזל הידרופובי. חלבונים הידרופילים ירוצו פחות רחוק.
- סילקציה - קולונה בעלת שרפים הידרופילים/הידרופוביים.מבוסס על מחלף יונים.
pH אופטימלי (PI) – לכל חלבון, קיים PH אחד בו מטעניו (של החלבון) שווים לאפס. ב-PI זה, החלבונים יעברו אגרגציה.
גרף של Ph אינו סימטרי, בגרף תהיה נקודת מקסימלית אחת (בהנחה שבתערובת קיים חלבון יחיד)