ביוטכנולוגיה/מעבדות/השפעת ה-pH על פעילות האנזים אינברטז

הקדמה

עריכה

בניסוי זה ובניסוי השפעת הטמפרטורה על פעילות האנזים טריפסין אנו נבצע את הנלמד מפרק הלימוד ביוכימיה - השפעת PH על מבנה חלבון. הבנת החומר התאורתי תקל על פתרון השאלות.

פעילות לעצירת פעילות אנזים :

עריכה
  • חום – דנטורציה.
  • סמנר - חומצה חלשה.

ראה : ביוכימיה – מטעני חלבון.

הניסוי

עריכה
  • אנזים: אינברטאז - אנזים המפרק סוכרוז (סוכר לא מחזר) לגלוקוז ולפרוקטוז (סוכרים מחזרים). מצוי בכמויות גבוהות בשמרי אפייה.
  • סובסטרט : סוכרוז.
  • קשר גליקוזיצי – קשר בין סוכרים הנוצר ע"י פליטת מולקולת מים. הקשר נוצר בין פחמן קרבוקסילי אחד לפחמן של הסוכר אחר.

נוסחאות

עריכה

הנוסחאות שיש לדעת :

  1. פעילות ספציפית (Specific Activity)
  2. העשרה
  3. ניצולת

ראה :

  • מושגים - שיטות ניקוי- מעקב אחר ניקוי חלבון בטבלת העשרה
  • חישובים

מהלך הניסוי

עריכה

מציאת pH אופטימלי עבור אנזים

עריכה
  • שורה של מבחנות בעלות pH שונה עם סובסטרט.
  • הוספת האנזים (במקרה שלנו הוספת אינברטאז).
  • הוספת מגיב לתוצר הפירוק(סמנר או סמירנוף למשל) או לסובסטרט.
  • מרתיחים.
  • קריאה (במקרה שלנו באורך גל 540mn) ובדיקת פעילות (ע"פ הגרף שנוצר).

בקרות ואיפוסים

עריכה
  1. מבחנה ללא אנזים וסוכרוז (סמנר בלבד) – לאיפוס ספקטופוטומטר ; נטו ערך בליעה.
  2. מבחנה עם סובסטרט – לבדיקת פירוק הספונטאני של הסובסטרט.
  3. מבחנה עם אנזים – לבדיקת פעילות האנזים.

הקשר בין יציבות האנזים ל-pH וטמפרטורה אופטימלי

עריכה

אין קשר בין pH וטמפרטורה אופטימאלית לבין יציבות האנזים. יתכן כי האנזים פועל בטמפרטורה או pH מסוים אך אינו יציב.

מהלך הניסוי

עריכה
  1. לקיחת שורת מבחנות בעלות pH שונים עולים.
  2. הוספה אנזים (אינברטאז) וסובסטרט (סוכרוז) לכל המבחנות.
  3. הפסקת פעולה אחרי 5 דקות, בהוספת הסמנר (חומצה).
  4. הנחה במים רותחים.
  5. קריאת אחוז בליעה (לסמנר" 540nm).

בקרות :

  • מבחנה עם סוכרוז - למציאת התפרקות ספונטי של הסובסטרט.
  • מבחנה עם אנזים.
  • מבחנה ללא סוכרוז ואנזים לאיפוס.

חומר נוסף

עריכה

שיטות הפרדת חלבון (דיאגנוסטי פופרטיבי = אבחון לניקוי חלבון)

עריכה

תבנית:לאחד לתוך

  • דיאליזה
  • כמוטוגרפיה בג'ל.
  • ג'ל פילטרציה/מסננת מולקולרית.
  • השקעה איזואלקטרית (ב-PI)
  • מחליף יונים.
  • אלקטרופורזה בנייר.
  • כמוטוגרפית זיקה.
להסברים ראה : שיטות הפרדה
  • דנטורציה בחום – ביצוע דנטורציה לחלבונים. כתוצאה מכך כל החלבונים ההידרופוביים יתחברו ויצרו משקע. כמובן, שלא נבצע דנטורציה עבור החלבון המבוקש.
  • השקעה במלח
  • TLC - הרצה על נייר הידרופילי בנוזל הידרופובי. חלבונים הידרופילים ירוצו פחות רחוק.
  • סילקציה - קולונה בעלת שרפים הידרופילים/הידרופוביים.מבוסס על מחלף יונים.

pH אופטימלי (PI) – לכל חלבון, קיים PH אחד בו מטעניו (של החלבון) שווים לאפס. ב-PI זה, החלבונים יעברו אגרגציה.

גרף של Ph אינו סימטרי, בגרף תהיה נקודת מקסימלית אחת (בהנחה שבתערובת קיים חלבון יחיד)

קישורים חיצוניים

עריכה

מעבדה 8.3 מתוך "לקט ניסויים בביוכימיה מכשירית"